Chromatographie
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Histoire
Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à utiliser le terme chromatographie.
À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot chromatographie à partir du grec chroma- pour couleur et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais cette explication; mais on notera que tswett est le mot russe pour couleur.
En 1952, Martin et Synge reçurent le prix Nobel de chimie pour leur invention de la chromatographie par partition. [1]
Principe
L'échantillon est entrainé par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a tendance à retenir les substances de l'échantillon à l'aide d'interactions chimiques comme les forces de van der Waals (il ne s'agit pas de réaction chimique). Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse de séparation caractéristique qui permet de les séparer les uns des autres voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. Souvent on analyse en parallèle l'échantillon avec des susbtances connues dont on soupçonne la présence dans l'échantillon et qui servent de références, ce qui permet d'identifier chaque fraction de l'échantillon en comparant sa vitesse de séparation avec les références. Dans d'autres cas, on se contente de récolter les fractions qui devront être identifier par d'autres techniques.
La chromatographe analytique est utilisée pour déterminer quels composés chimiques sont présent dans le mélange ainsi que leur concentration. La chromatographie préparative est utilisée pour purifier des quantités plus importantes du produits en vue d'autres utilisations.
Il existe de nombreux types de chromatographie, comme par exemple :
- la chromatographie en phase gazeuse (GPC);
- la chromatographie en phase liquide;
- la chromatographie chirale.
Chromatographie sur papier
Cromatography_tank_fr.png
schéma d'une chromatographie sur papier
Chromato.jpg
Résultat d'une chromatographie de base sur papier filtre. Fait avec des feuilles d'épinard
Dans cette technique, une petite quantité de la ou les solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. Toutes substances qui réagirait avec le papier ne peut être analyser à l'aide de cette technique. Le papier est ensuite trempé dans un solvant comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon qui commence à monter avec celui-ci. Les différentes substances constituants l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier.
La chromatographie sur papier demande un certain temps; généralement plusieurs heures. Une fois que c'est fini, généralement quand le front de solvant est presque arrivé en haut du papier, la papier est retiré de la cuve est on laisse évaporer le solvant. Le résultat est appelé chromatogramme'.
Le chromatogramme est utilisé pour le comparer avec d'autres analyses effectués sur des substances connues et pris dans des conditions identiques pour identifier les substances de l'échantillon. Les substances peuvent être identifiées en calculant la valeur Rf qui peut être comparée à celles se trouvant dans les tables. Cette valeur est calculée de la façon suivante:
Rf = (distance parcourue par l'échantillon) / (distance parcourue par le solvant)
Il y a plusieurs façon pour identifier les endroits où se trouvent les produits ainsi séparés:
- les produit sont colorés, il n'y a rien de spécial à faire.
- les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette.
- sinon, il faut utiliser une révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les détruisant) et dont le résultat sera coloré.
Pour séparer des mélanges complexes de substances similaires, il peut être utile d'utiliser la chromatographie à 2 dimensions. Celle-ci s'effectue en deux étapes entre lesquelles on change de solvant et on tourne le papier de 90°.
En tant que technique micro-préparative, on peut souhaité récupérer les produits ainsi séparés; on découpe alors dans le papier les endroits où se trouvent le ou les produits à récupérer que l'on redissous ensuite. Les quantités ainsi récupérées sont de l'ordre du milligramme voir moins.
Chromatographie sur couches minces
Cette technique est similaire à la chromatographie sur papier mais le support adsorbant, généralement du gel de silice, du sulfate de calcium ou de l'alumine, est une mince couche déposée sur une plaque de verre, d'aluminium ou de plastique. Cette couche est simplement séchée ou peut subir d'autres traitements, comme une cuisson, qui permettent de maitenir sa cohésion ou de l'activer. L'absorbant peut également contenir un colorant fluorescent, ce qui permet de visualiser sous une lampe UV à longueur d'ondes courte (254nm) les composés absorbant à cette longueur d'ondes.
Les avantages par rapport à la chromatographie sur papier est que de plus grandes séparation peuvent être obtenues avec une moindre distance totale et que l'on peut utiliser plusieurs types d'adsorbants.
Avec les progrès récents dans la maîtrise des supports et les progrès de l'instrumentation (automatisation des dépôts, « scanners » pour révéler les chromatogrammes), la chromatographie sur couches minces connaît un second souffle. Sa sensibilité peut être comparable, voire meilleure, que celle des autres techniques chromatographiques, et elle redevient populaire, en particulier dans l'analyse des principes actifs pharmaceutiques.